实验二十八 厌氧微生物的培养

一、基本原理
　　厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，作用也日益引起重视。培养厌氧微生物的技术关键是要使该类微生物处于除去了氧或氧化还原势低的环境中。
　　焦性没食子酸与碱性溶液作用后，形成碱性没食子酸盐，在此反应过程中能吸收氧气而造成厌氧环境；牛肉渣内既含有不饱和脂肪酸能吸收氧，又含有*（glutathione）能形成负氧化还原电位差；厌氧罐是采用某种方法除去其中的氧，例如将镁与氧化锌制成产氢气袋，放入罐中加水反应产生氢，钯或铂是催化剂，在常温下催化氢与氧化合成水，则可除去密封的厌氧罐中的氧。
二、器材
　　巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridium pas- teurianum），荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）；
　　焦性没食子酸，棉花，10%NaOH，灭菌的石蜡凡士林（1∶1），牛肉，蛋白陈，葡萄糖， NaCl，肉膏蛋白胨琼脂培养基，小试管肉膏蛋白胨琼脂斜面，厌氧罐，催化剂袋，气体发生袋，指示剂袋，灭菌的带橡皮塞或螺旋帽的大试管，灭菌的玻璃板（直径比培养皿大3—4 cm），灭菌的滴管，烧瓶，刀等。
三、操作步骤
　　1．焦性没食子酸法
　　（1）大管套小管法在大试管中放入少许棉花和焦性没食子酸，焦性没食子酸的用量按它在过量碱液中能每克吸收100ml空气中的氧来估计，本实验用量约0．5g。接种巴氏芽孢梭菌在小试管肉膏蛋白胨琼脂斜面上，迅速滴入10％的NaOH于大试管中，使焦性没食子酸润湿，并立即放入除掉棉塞已接种菌的小试管斜面（小试管口朝上），塞上橡皮塞或拧上螺旋帽，置30℃培养。
　　（2）培养皿法取玻璃板一块或用培养皿盖，铺上一薄层灭菌脱脂棉，将1g焦性没食子酸放于其上。用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半划线接种巴氏芽孢梭菌，下一半划线接种荧光假单胞菌，并在皿底用记号笔作好标记。滴加10％NaOH溶液约2ml于焦性没食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养皿盖上，必须将脱脂棉全部罩住，焦性没食子酸反应物切勿与培养基表面接触，以溶化的石蜡凡士林液（即vaspar）密封皿底与玻璃板或皿盖的接触处。置30℃温箱培养。
　　2．疱肉培养基法
　　（1）取已除去筋膜、脂肪的牛肉500g，切成小方块，置1000ml蒸馏水中，以小火煮1小时，用纱布过滤，挤干肉汁，将肉汁保留备用。再将肉渣用绞肉机绞碎，或用刀切碎，使其成细粒。
　　（2）将保留的肉汁加蒸馏水，使总体积为2000ml，加入20g蛋白陈，2g葡萄糖，5gNaCl和绞碎的肉渣。置烧瓶中摇均匀，加热使蛋白胨溶化。
　　（3）取上层溶液调整pH为8．0，在烧瓶壁上用记号笔标明瓶内液体高度，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟后补足蒸发的水量，重新调整pH为8．0，再煮沸10—20分钟，补足水量，再调整pH为7．4。
　　（4）把烧瓶内容物摇匀，将溶液和肉渣分装于小试管中，肉渣约用，应用无菌手续加入已灭菌的石蜡凡士林，以隔绝氧气。
　　（5）接种前可将上述已做好的庖肉培养基煮沸10分钟，以除去溶入的氧，如果盖有一层石蜡凡士林，需将石蜡凡士林先在火焰边微加热，使其溶化。在培养基手感不烫时按液体接种法接入巴氏芽孢梭菌，然后将接种的试管垂直，使石蜡凡士林凝固而密封培养基。再置30℃中培养。
　　3．厌氧罐培养法
　　（1）用肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板，凝固干燥后，取两个平板，每个平板一半边划线接种巴氏芽孢梭菌，另一半边划线接种荧光假单胞菌，并标记好。取其中的一个已接种的平皿置于厌氧罐的培养皿支架上，而后放入厌氧培养罐内；另一个已接种的平皿置培养室30℃培养。
　　（2）剪开催化剂袋，将催化剂倒入厌氧罐盖下面的多孔催化剂盒内，拧紧催化剂盒的盒盖。
　　（3）剪开气体发生袋的切碎线处，并迅速将此气体发生袋置罐内金属架的夹上，再向袋中加入约10 ml水。同时，由另一人配合，剪开指示剂袋，将指示条暴露，立即放进罐内。
　　（4）迅速盖好厌氧罐的盖，将固定梁旋紧，置 30℃培养，如图Ⅶ-11所示。
四、实验报告