DNA 的定?与接合反应

品试剂：
纯化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段
1% 6-well agarose gel
DNA 标准分子? （λMr, 0.5 μg/μL）

方法步骤：
1） 取4 支微?离心管，依下表加入DNA, TE-8.0 及追踪染剂 （μL）：

2） 短暂离心混合后，将各管样品置65℃水浴5~10 min 后，移至冰浴?温后进?电泳分析。
3） 将胶体置于UV transilluminator 上观察各色带的??，与已知?的 λMr 比较，找出分别与#3, #4 ??相当的片段。
4） 估计 #3, #4 的DNA ?及计算每 μL 所含的莫耳数。

纯化的gusA 片段与经BamHI/HindIII 作用的pQE31 片段混合后，末端序?互补的部份会进?黏合，但仍须藉由DNA ligase 催化phosphodiester bond 的形成，将缺口接合起?。

仪器用具：12℃恒温槽

药品试剂：
纯化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段
T4 DNA ligase （1 U/μL, Invitrogen）
5×T4 DNA ligase buffer （0.25 M Tris-HCl, pH 7.6; 50 mM MgCl2; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% PEG-8000）

方法步骤：
1） 两种DNA 片段于65℃水浴加热10 min 后，置冰浴中。
2） 取5 支微?离心管置冰浴中，依下表所? （单位 μL） 依序加入各成份：

* Vector 与Insert 的比?为莫耳数比，DNA 总?为100 ng。
3） #1~#4 置于12℃反应过夜，#5 则?加ligase，直接置于4℃冰箱。
4） #1~#4 反应过夜后，以70℃加热10 min，置冰浴中。